Les nucléases, de fabuleux outils pour la chirurgie du génome : les Etats-Unis se mobilisent

, Partager

Le génie génétique est un ensemble de techniques de biologie moléculaire, qui vise à modifier le génome des êtres vivants [1]. La thérapie génique fait appel à ces techniques pour soigner ou prévenir des pathologies causées par des aberrations (mutations) dans l’ADN d’un individu. L’approche classique consiste à insérer une copie fonctionnelle du gène déficient dans le génome mais cette méthode est limitée par le caractère aléatoire de l’insertion. Le transgène inséré peut en effet perturber, voire inactiver, l’expression d’un autre gène et être ainsi à l’origine d’effets indésirables graves. En outre, selon l’endroit d’insertion dans le génome, il est possible que l’expression du gène ne soit pas physiologique. Il peut, par exemple, être surexprimé ou sous-exprimé par rapport à son expression habituelle [2] [3] [4]. Au cours de ces dernières années, de nouvelles techniques plus précises, basées sur l’utilisation d’enzymes de restriction, sont apparues. Elles permettent une correction ciblée et stable du génome et suscitent de nombreux espoirs pour améliorer la thérapie génique.


L’ADN, dont la structure est une double hélice, est composé de paires de bases (nucléotides) dans un ordre défini. Quand un gène présente une mutation, la protéine pour laquelle il code peut être altérée et perdre sa fonction, ce qui peut entraîner une pathologie.
Crédits : Wavebreakmedia


La découverte des enzymes de restriction, en 1965, a révolutionné la biologie moléculaire, en apportant aux chercheurs de merveilleux outils (des ciseaux moléculaires) pour la manipulation de l’ADN. Ces enzymes, de la famille des nucléases, sont des protéines qui coupent l’ADN au niveau de séquences spécifiques, pour la plupart palindromiques (c’est-à-dire qu’elles se lisent de droite à gauche et inversement), appelées sites de restriction [5]. Dans la nature, elles sont synthétisées par les bactéries et leur confèrent une immunité en découpant l’ADN viral. En génie génétique, ces enzymes sont utilisées pour générer des coupures de l’ADN double-brin à un endroit précis du génome [6]. Les mécanismes cellulaires naturels vont alors se mettre en marche pour réparer l’ADN. Si une copie "saine" du gène à restaurer est délivrée dans la cellule, elle va servir de matrice de réparation permettant ainsi la reconstitution d’un gène complet et fonctionnel [7]. Quatre types de nucléases, décrits ci-dessous, sont utilisés pour la correction ciblée du génome [8].

Les méganucléases

A la fin des années 1990, les méganucléases sont apparues comme un outil prometteur pour la modification du génome. Ces enzymes naturelles sont capables de reconnaître de longues séquences d’ADN (séquences de 12 à 40 paires de bases), qui ne sont généralement présentes qu’une seule fois dans le génome, et au niveau desquelles elles peuvent générer des coupures double-brin. Cette propriété confère donc aux méganucléases une forte spécificité d’action [9].

Cependant, bien que chaque méganucléase présente des variations dans son site de reconnaissance de l’ADN, il est très difficile de trouver l’enzyme nécessaire pour agir sur une séquence d’ADN donnée. C’est pourquoi, des efforts ont été faits pour produire des méganucléases "sur mesure", en modifiant par mutagénèse la spécificité de méganucléases existantes ou en créant des méganucléases chimériques par association de domaines protéiques issus d’enzymes différentes. Une large banque comprenant plusieurs dizaines de milliers d’unités protéiques a ainsi été créée. Nous pouvons citer la société française Cellectis, créée en 1999, qui a été pionnière dans ce domaine et qui produit chaque année plusieurs dizaines de méganucléases à spécificité modifiée [10]. Aux Etats-Unis, le Northwest Genome Engineering Consortium, financé par les NIH (National Institutes of Health) a adopté une stratégie bioinformatique pour tenter de prédire le plus précisément possible l’activité des méganucléases et la spécificité de la séquence nucléique reconnue [11] [12]. Le modèle est ensuite vérifié par des mutagénèses dirigées et des analyses biochimiques in vitro.

Les nucléases à doigts de zinc

Les nucléases à doigts de zinc sont des protéines hybrides créées à partir de la fusion de gènes codant pour les protéines à doigts de zinc, qui permettent l’interaction avec une séquence d’ADN définie, avec celui codant pour la région catalytique de l’enzyme de restriction FokI, qui apporte l’activité enzymatique. Chaque doigt de zinc reconnaît une courte séquence spécifique (trois nucléotides) mais l’association de plusieurs domaines doigts de zinc appropriés permet de cibler de manière unique la séquence d’intérêt [13]. Le domaine catalytique de FokI doit se dimériser pour pouvoir couper l’ADN. Ainsi, la correction du génome nécessite deux nucléases à doigts de zinc, ciblant chacune des séquences d’ADN éloignées l’une de l’autre de quelques nucléotides. La liaison des protéines à doigts de zinc va permettre le rapprochement des deux domaines catalytiques de FokI, qui vont alors se dimériser et couper l’ADN. En plus d’être un outil ingénieux à disposition de la communauté scientifique, ces nucléases pourraient prochainement être utilisées dans le domaine de la santé. En particulier, la compagnie américaine Sangamo BioSciences est en train de développer un traitement anti-VIH, basé sur les nucléases à doigts de zinc. Les nucléases seraient utilisées pour introduire une mutation dans le gène codant pour le corécepteur CCR5, nécessaire pour l’entrée du virus du sida dans les cellules T. L’inactivation du récepteur CCR5 confère donc une résistance au virus [14] [15]. Les essais cliniques de phase II sont actuellement en cours. En outre, la société, en collaboration avec l’institut City of Hope et l’Université de Californie du Sud, étudie la possibilité d’étendre cette technique aux cellules souches hématopoïétiques. En mai 2014, ils ont d’ailleurs reçu le Strategic Partnership Award et une bourse de 5,6 millions de dollars, pour financer les essais cliniques [16].

Les Transcription Activator Like-Effectors (TALENs)

Les TALENs sont des enzymes artificielles créées en fusionnant un domaine de liaison à l’ADN spécifique (succession de TAL effectors) et le domaine catalytique de l’enzyme FokI [17]. Les TAL effectors sont des protéines sécrétées par la bactérie phytopathogène Xanthomonas, qui lient des séquences particulières du génome de la plante [18]. La séquence protéique d’un TAL effector varie au niveau de deux acides aminés, qui sont impliqués dans la reconnaissance spécifique d’un nucléotide particulier dans le génome. En conséquence, en combinant différents TAL effectors, le domaine de liaison à l’ADN des TALENs peut reconnaître une séquence génomique d’intérêt. Comme pour les nucléases à doigts de zinc, deux TALENs, ciblant chacune des séquences d’ADN de part et d’autre du site où doit avoir lieu la coupure, sont utilisées pour modifier le génome et le rapprochement des deux domaines de FokI va permettre la cassure de l’ADN double brin [19]. A titre d’exemple, des chercheurs américains ont ainsi réussi à corriger, dans des cellules humaines, la mutation du gène codant pour la β-globine, responsable de la drépanocytose [20]. La société Cellectis, citée précédemment, et la multinationale américaine Thermo Fisher Scientific ont signé un accord, en juin dernier, concernant l’utilisation des nucléases TAL, sous la marque TALEN [21].

Le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

Une nouvelle génération d’outils pour la réparation du génome, basée sur le système CRISPR, est maintenant disponible pour la communauté scientifique. Cette méthode s’est développée de façon remarquable ces deux dernières années, en partie grâce à sa simplicité d’utilisation et à son efficacité [22]. Dans la nature, CRISPR est la base du système immunitaire adaptatif des bactéries et des archées. En effet, les répétitions CRISPR sont composées d’une courte séquence de nucléotides suivies par, plus ou moins, la même séquence inversée (séquence palindromique) et d’une séquence "spacer" d’environ 30 paires de bases [23]. Ce "spacer" est de l’ADN viral qui a été inséré dans le génome de l’hôte, à la suite d’une précédente infection par un virus. Une fois la séquence CRISPR transcrite en ARN (crRNA), la séquence du "spacer" va reconnaître sa séquence complémentaire dans le génome du virus. Des protéines Cas (CRISPR-associated) vont ensuite se lier à la séquence palindromique du crRNA et provoquer la cassure de l’ADN du virus, neutralisant ainsi l’invasion. Les fragments d’ADN viral produits sont alors incorporés dans le génome de l’hôte, comme de nouveaux "spacers", et seront transmis lors de la division microbienne. En conséquence, les descendants de chaque individu porteront la trace de cette infection virale. Depuis peu, les biologistes ont tiré profit de ce processus pour permettre une modification ciblée d’un gène défectueux.

En 2013, une équipe de l’Université de Californie, à Berkeley, a construit des ARN, analogues aux séquences CRISPR, qui permettent de recruter la protéine Cas9 et d’induire, à un site spécifique, la cassure de l’ADN dans des cellules humaines [24]. Par ailleurs, un groupe du Broad Institute du MIT et d’Harvard a montré que, grâce à l’utilisation de différentes séquences "spacers" cibles, il était possible de corriger simultanément plusieurs sites du génome humain [25]. Aux Etats-Unis, de nombreuses sociétés ont saisi le potentiel de la technologie CRISPR et la guerre des brevets a été déclenchée. Les chercheurs du Broad Institute ont déposé un brevet et créé la startup Editas Medicine [26]. D’autre part, le Broad Insitute a signé, le 4 décembre dernier, des accords non exclusifs avec les compagnies GE Healthcare Life Sciences et Sigma-Aldrich, pour autoriser l’accès à leur propriété intellectuelle [27]. GE Healthcare Life Sciences a d’ailleurs inauguré, en octobre, une plateforme basée sur le système CRISPR/Cas9, dédiée à la création permanente et héréditaire de mutations de gènes dans des cellules, en seulement une à deux semaines (les techniques classiques nécessitent un mois). Sigma-Aldrich, quant à elle, souhaite produire cet outil génétique pour diverses applications, comme la création de lignées cellulaires sur mesure et les criblages génétiques. De leur côté, Jennifer Doudna, de l’Université de Californie, et la française Emmanuelle Charpentier, du Helmholtz Centre for Infection Research en Allemagne, ont chacune reçu, le mois dernier, le Breakthrough Prize de trois millions de dollars et ont respectivement vendu leur technique aux sociétés Intellia Therapeutics, située à Cambridge dans le Massachusetts, et CRISPR Therapeutics, basée en Suisse [28].

En conclusion, le génie génétique est un domaine en plein essor, grâce au développement de différentes techniques reposant sur l’utilisation de nucléases qui améliorent la spécificité d’action dans le génome. Ces technologies apportent des outils moléculaires très ingénieux pour la communauté scientifique et sont en passe de révolutionner la médecine personnalisée et la thérapie génique. En effet, de nombreuses pathologies sont causées par des mutations dans l’ADN et la possibilité de réparer le gène altéré directement au coeur de la cellule suscite beaucoup d’espoirs. Cette technique engendre aussi des craintes car plusieurs interrogations restent en suspens, comme par exemple celles de la spécificité relative de chaque nucléase ou l’utilisation de vecteurs appropriés pour le transfert de ces enzymes à l’intérieur des cellules et des organismes [29].

Code ADIT : 77394


Rédactrice :


- Perrine Viargues, Attachée Scientifique Adjointe - Atlanta, deputy-univ@ambascience-usa.org ;
- Retrouvez toutes nos activités sur le site du Consulat général de France à Atlanta : http://www.consulfrance-atlanta.org/spip.php?rubrique435.